میکروسکوپ فلورسانس یک تکنیک قدرتمند است که به محققان اجازه می دهد تا مولکول ها و ساختارهای خاصی را در سلول ها و بافت ها تجسم کنند. برای آماده‌سازی نمونه‌ها برای میکروسکوپ فلورسانس، اغلب از یک میکروتوم کرایوستات برای برش بخش‌های نازک بافت منجمد استفاده می‌شود. در این پست وبلاگ، با تکیه بر تجربه خود به عنوان تامین کننده میکروتوم کرایوستات، اطلاعاتی در مورد نحوه استفاده از میکروتوم کرایوستات برای میکروسکوپ فلورسانس به اشتراک خواهم گذاشت.
آشنایی با میکروتوم کرایوستات
میکروتوم کرایوستات یک ابزار تخصصی است که برای برش بخش های نازک بافت منجمد در دماهای پایین طراحی شده است. این شامل یک تیغه برش، یک نگهدارنده نمونه و یک محفظه کنترل شده با دما است. دمای پایین به حفظ ساختار بافت و جلوگیری از تخریب مولکول های فلورسنت کمک می کند.
انواع مختلفی از میکروتوم های کرایوستات در بازار موجود است. به عنوان مثال،کرایوتومقابلیت برش دقیق را ارائه می دهد، در حالی کهکرایوستات نیمه اتوماتیکتعادل خوبی بین اتوماسیون و کنترل کاربر فراهم می کند. ماکرایوستات میکروتومترکیبی از ویژگی های پیشرفته برای پاسخگویی به نیازهای مختلف محققان.
آماده سازی میکروتوم کرایوستات
قبل از استفاده از میکروتوم کرایوستات، آماده سازی صحیح ابزار ضروری است. ابتدا تیغه برش و نگهدارنده نمونه را تمیز کنید تا هر گونه زباله یا آلودگی پاک شود. برای اطمینان از تمیز کردن کامل از یک محلول تمیز کننده مناسب و یک برس نرم استفاده کنید.
سپس دمای محفظه کرایوستات را تنظیم کنید. دمای ایده آل بستگی به نوع بافتی دارد که برش داده می شود. به طور کلی دمای بین 18- تا 25- درجه سانتی گراد برای اکثر بافت ها مناسب است. قبل از ادامه، اجازه دهید کرایوستات به دمای تنظیم شده برسد.
آماده سازی نمونه بافت
کیفیت آماده سازی نمونه بافت برای میکروسکوپ فلورسانس موفق بسیار مهم است. با تثبیت بافت در فیکساتور مناسب شروع کنید. برای میکروسکوپ فلورسانس، فیکساتورهایی مانند پارافورمالدئید معمولا استفاده می شود زیرا سیگنال های فلورسنت را به خوبی حفظ می کنند.
پس از تثبیت، بافت باید در سرما محافظت شود. این شامل غوطه ور کردن بافت در محلول ضد سرما، مانند ساکارز، برای جلوگیری از تشکیل کریستال یخ در هنگام انجماد است. سپس بافت در یک محیط انجماد مناسب مانند ترکیب OCT منجمد می شود.
نصب بافت روی نگهدارنده نمونه
هنگامی که بافت منجمد شد، باید روی نگهدارنده نمونه نصب شود. بلوک بافت منجمد را با دقت روی نگهدارنده نمونه قرار دهید و با استفاده از دستگاه نصب مناسب آن را محکم کنید. اطمینان حاصل کنید که بافت در مرکز و محکم به نگهدارنده چسبیده است تا از برش دقیق اطمینان حاصل شود.
تنظیم پارامترهای بخش بندی
قبل از شروع فرآیند برش، پارامترهای برش را روی میکروتوم کرایوستات تنظیم کنید. این پارامترها شامل ضخامت مقطع، سرعت برش و سرعت پیشروی می باشد. ضخامت مقطع بستگی به نوع بافت و الزامات آزمایش میکروسکوپ فلورسانس دارد. برای اکثر کاربردها، ضخامت مقطع 5 تا 10 میکرومتر مناسب است.
سرعت برش و سرعت پیشروی باید بر اساس سختی بافت تنظیم شود. بافت‌های نرم‌تر ممکن است به سرعت برش کمتر و سرعت پیشروی کمتری نیاز داشته باشند، در حالی که بافت‌های سخت‌تر می‌توانند سرعت برش سریع‌تری را تحمل کنند.
برش دادن بافت
پس از تنظیم پارامترها، فرآیند برش را شروع کنید. نگهدارنده نمونه را به آرامی به سمت تیغه برش ببرید. همانطور که تیغه از طریق بافت بریده می شود، بخش های نازکی ایجاد می شود. با استفاده از یک برس خوب یا یک برس بالابر، بخش ها را به دقت روی یک اسلاید شیشه ای منتقل کنید.
مهم است که بخش ها را به آرامی اداره کنید تا آسیب نبیند. اطمینان حاصل کنید که بخش ها به طور مساوی روی اسلاید توزیع شده اند و روی هم قرار نمی گیرند.
رنگ آمیزی فلورسنت مقاطع
بعد از برش، مرحله بعدی رنگ آمیزی مقاطع با رنگ های فلورسنت است. رنگ‌های فلورسنت مختلفی برای کاربردهای مختلف موجود است، مانند DAPI برای رنگ‌آمیزی هسته‌ای و رنگ‌های فلورسنت الکسا برای برچسب‌گذاری پروتئین خاص.
محلول رنگ آمیزی را طبق دستورالعمل سازنده آماده کنید. بخش ها را در محلول رنگ آمیزی به مدت مناسب انکوبه کنید. پس از رنگ آمیزی، قسمت ها را کاملا بشویید تا رنگ اضافی از بین برود.
نصب بخش های رنگ آمیزی شده
پس از رنگ آمیزی بخش ها، باید آنها را روی یک روکش نصب کنید. از یک محیط نصب مناسب که با رنگ های فلورسنت سازگار است استفاده کنید. قطره ای از محیط نصب را روی قسمت های لکه دار قرار دهید و با احتیاط ورقه را روی لام پایین بیاورید تا از تشکیل حباب های هوا جلوگیری کنید.
تصویربرداری از بخش ها
در نهایت، مقاطع رنگ آمیزی شده برای میکروسکوپ فلورسانس آماده می شوند. لام را روی صحنه میکروسکوپ قرار دهید و فوکوس و بزرگنمایی را برای تجسم سیگنال های فلورسنت تنظیم کنید. از فیلترهای مناسب برای تشخیص رنگ های فلورسنت مختلف استفاده کنید.
عیب یابی و نکات
- کیفیت بخش: اگر قسمت ها چروک یا پاره شده اند، تیغه برش را از نظر تیرگی یا آسیب بررسی کنید. یک تیغه تیز برای تولید مقاطع با کیفیت بالا ضروری است.
- سیگنال فلورسنت: اگر سیگنال فلورسنت ضعیف است، پروتکل رنگ آمیزی را بررسی کنید. مطمئن شوید که زمان رنگ‌آمیزی و غلظت رنگ مناسب است. همچنین، مطمئن شوید که بخش ها بیش از حد شسته نشده اند، زیرا این کار می تواند سیگنال فلورسنت را کاهش دهد.
- کنترل دما: دمای ثابت را در محفظه کرایوستات در طول فرآیند برش نگه دارید. نوسانات دما می تواند بر کیفیت بخش ها تأثیر بگذارد.
برای خرید و مشاوره تماس بگیرید
اگر علاقه مند به خرید میکروتوم کرایوستات برای نیازهای میکروسکوپ فلورسانس خود هستید، یا اگر در مورد استفاده از آن سؤالی دارید، با ما تماس بگیرید. تیم کارشناسان ما آماده کمک به شما در یافتن ابزار مناسب برای تحقیق شما هستند.
مراجع
- بافت شناسی: متن و اطلس نوشته مایکل اچ. راس و وویسیچ پاولینا.
- میکروسکوپ فلورسانس: اصول، تکنیک ها و کاربردها توسط ریچارد پی. هاگلند.